История церкви начинается не позднее 1790 г., когда на новом Заглинковском кладбище, тогда находившемся за городской чертой, был построен храм, освященный в честь Рождества Пресвятой Богородицы. Вскоре по церкви кладбище стало называться Богородским.
В 1833–1836 гг. по проекту губернского архитектора Н.А.Трубчанкина взамен небольшой обветшавшей церкви был построен существующий ныне более вместительный храм. В XIX в. он был украшен масляной живописью, которая частично сохранилась до наших дней и в 2011 г. отреставрирована О.А.Соколовой.
11 октября 1836 г. нижний теплый храм был освящен во имя Рождества Пресвятой Богородицы, а 11 июня 1839 г. престол в верхней холодной церкви – во имя Рождества Христова. Позже в нижнем храме были устроены приделы в честь Трех вселенских святителей и мучениц Веры, Надежды, Любови и матери их Софии, а в холодном – во имя Максима Исповедника и святых благоверных князей Бориса и Глеба.
В советской время Рожество-Богородицкий храм оказался единственным в Вологде и ее ближайших окрестностях, который никогда не закрывался. С 1927 по 1938 г. в нем сосуществовали обновленческая община, которой был передан второй этаж, и «староцерковники» – объединившиеся в Богородицком нижнем храме самые стойкие прихожане и клирики из закрытых церквей Вологды во главе с протоиереем Константином Богословским. Большинство священников были репрессированы в 1937 г. К их числу принадлежит, в частности, протодиакон Иоанн Преображенский (1880–1938). Весной 1937 г. Вологду всколыхнуло известие о том, что под предлогом строительства новых железнодорожных путей и реконструкции транспортного узла власти закрыли Богородское кладбище, а захоронения собираются перенести на новое место. Весь причт храма, в том числе и диакон Иоанн Преображенский, подписал письмо во ВЦИК, в котором призывал власти не уничтожать кладбище. Вскоре после этого священники, диаконы и некоторые из прихожан были арестованы по обвинению в том, что они, являясь участниками контрреволюционной церковно-монархической группы, ведут непримиримую борьбу против советской власти и распространяют клеветнические измышления. 19 сентября 1937 г. тройка НКВД приговорила диакона Иоанна к десяти годам заключения в исправительно-трудовом лагере. Он скончался в Каргопольском лагере 11 июня 1938 г. 13–16 августа 2000 г. протодиакон Иоанн Преображенский в лике священномученика был канонизирован Архиерейским Собором Русской Православной Церкви.
В декабре 1938 г. занятый обновленцами верхний храм закрыли; в нем размещался архив НКВД, а в годы войны – склад. После войны верхний храм был передан верующим. С 1947 г. до 2014 г. Рождество-Богородицкая церковь являлась кафедральным собором Вологодской епархии.
